人鈣衛(wèi)蛋白elisa試劑盒實驗原理 人鈣衛(wèi)蛋白elisa試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin）水平。用純化的人鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin），再與HRP標記的鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin）濃度。 
1.包被：抗原/抗體，固相化 2.反應： 1)待測抗體/抗原； 2)酶標抗原/抗體 3.洗滌：使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離 4.底物顯色：定性/定量分析 常用的酶與底物： 酶底物顯色測定波長辣根過氧化物酶horseradish pero xidase,HRP鄰苯二胺（OPD）橘紅色492nm四甲基聯(lián)苯胺（TMB）黃色450nm堿性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸鹽(p-NPP)黃色405nm終止液：2mol/L H2SO4
常見問題分析
Q1.標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色 溶解標準品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。 標準品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復吹打，效率較低、效果也不一定最佳。 Q2.標曲和樣本均不顯色 在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱。 推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。 Q3.標曲顯色，樣本不顯色 當樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度最高的方法，與不同技術結合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。 對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內，得到的數(shù)值也更加可信。 Q4.標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大 這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大；實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。 掌握移液器的正確使用和維護。關于個人的操作可練習移液動作、加快速度，確保移液的精密度。 Q5.本底偏高，樣本值測不到 標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導致無法測到樣本值。 在加入TMB顯色后，需實時觀察標曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應。 Q6.樣本經不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大 有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應該如何稀釋，那么我們就會做下預實驗，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢？ 這里涉及到了基質效應。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質效應較明顯。而經過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。 Q7.不同試劑盒中的組分能否通用 除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經過優(yōu)化的，如果貿然使用其它試劑盒的組分，有可能對結果產生影響。
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